高效液相色谱仪测定氨基酸的应用方案

一. 仪器及试剂
仪 器：
（1）天平一台（精度0.1mg）；
（2）恒温水浴锅一台；
（3）容量瓶；
（4）试管（1.5×15cm或1.5×10cm）；
（5）微量进样器（5ul或10µl）一支；
（6）微量可调移液枪（1000ul）一支、吸头多个；
（7）旋涡混匀器一台；
（8）HPLC系统及氨基酸分析专用柱（4.6×250mm）；
试 剂：
（1）超纯水（≥18MΩ·cm）；
（2）乙腈（HPLC级）；
（3）三水合醋酸钠（分析纯）；
（4）冰醋酸（分析纯）；
（5）衍生试剂A和衍生试剂B溶液，至于冰箱保存（衍生试剂包对身体有害，用时请做好防护措施）；
（6）正己烷（HPLC级）。

二. 流动相的配制
流动相A： 0.1mol/L醋酸钠溶液（pH 6.5）：乙睛＝93：7
配制方法：准确称取三水合醋酸钠13.6g于1000ml水中，搅拌均匀，使之溶解，用冰醋酸或氢氧化钠溶液调pH值至6.5；准确量取配制好的三水合醋酸钠溶液 465ml和乙腈35ml，混合均匀，抽滤过0.45µm滤膜；

流动相B：水：乙腈＝20：80
配制方法：准确量取水100ml和乙腈400ml，混合均匀，抽滤过0.45µm滤膜；
三. 衍生化反应
1.对照品溶液的制备
取17种氨基酸对照品溶液用水稀释至原来浓度的1/10倍稀释作为对照品。
17种氨基酸对照品溶液稀释10倍后，各氨基酸的浓度为：

2.供试品溶液制备
精密量取/称取供试品适量，并配制成相应浓度的溶液备用。
3.衍生步骤
1）将恒温水浴锅预热至50±1℃；
2）分别将A、B两种衍生试剂用稀释剂稀释至原来浓度的1/5倍；
3）精密量取上述对照品溶液1ml，置于试管中，加入稀释后的A溶液0.5ml和稀释后的B溶液0.5ml，摇匀；在50±1℃水浴中加热45分钟，取出，加入正己烷溶液1ml，振摇；并用孔径为0.45μm有机膜过滤，放置30分钟后，取澄清的下层液进行分析试验；
4）供试品的衍生步骤与对照品相同；

四. 色谱条件
1.色谱柱：EXFORMMA Amino Acid，5μm，4.6×250mm；
2.梯度程序：
流动相A： 0.1mol/L醋酸钠溶液（pH 6.5）：乙睛＝93：7
流动相B： 水：乙腈＝20：80

流速：1.0ml/min        
柱温：40℃        
波长：254nm        

进样量：5μl色谱图：
氨基酸标准品

溶解空白：