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关闭窗口 一. 仪器及试剂
仪 器：
（1）天平一台（精度0.1mg）；
（2）恒温水浴锅一台；
（3）容量瓶；
（4）试管（1.5×15cm或1.5×10cm）；
（5）微量进样器（5ul或10µl）一支；
（6）微量可调移液枪（1000ul）一支、吸头多个；
（7）旋涡混匀器一台；
（8）HPLC系统及氨基酸分析专用柱（4.6×250mm）；
试 剂：
（1）超纯水（≥18MΩ·cm）；
（2）乙腈（HPLC级）；
（3）三水合醋酸钠（分析纯）；
（4）冰醋酸（分析纯）；
（5）衍生试剂A和衍生试剂B溶液，至于冰箱保存（衍生试剂包对身体有害，用时请做好防护措施）；
（6）正己烷（HPLC级）。
二. 流动相的配制
流动相A： 0.1mol/L醋酸钠溶液（pH 6.5）：乙睛＝93：7
配制方法：准确称取三水合醋酸钠13.6g于1000ml水中，搅拌均匀，使之溶解，用冰醋酸或氢氧化钠溶液调pH值至6.5；准确量取配制好的三水合醋酸钠溶液 465ml和乙腈35ml，混合均匀，抽滤过0.45µm滤膜；
流动相B：水：乙腈＝20：80
配制方法：准确量取水100ml和乙腈400ml，混合均匀，抽滤过0.45µm滤膜；
三. 衍生化反应
1.对照品溶液的制备
取17种氨基酸对照品溶液用水稀释至原来浓度的1/10倍稀释作为对照品。
17种氨基酸对照品溶液稀释10倍后，各氨基酸的浓度为：
Name | M.W. | C(mmol/L) | C(mg/ml) | Name | M.W. | C(mmol/L) | C(mg/ml) |
门冬氨酸 | 133.10 | 0.25 | 0.03328 | 胱氨酸 | 240.30 | 0.125 | 0.03004 |
谷氨酸 | 147.13 | 0.25 | 0.03678 | 缬氨酸 | 117.15 | 0.25 | 0.02929 |
丝氨酸 | 105.09 | 0.25 | 0.02627 | 蛋氨酸 | 149.21 | 0.25 | 0.03730 |
甘氨酸 | 75.067 | 0.25 | 0.01877 | 异亮氨酸 | 131.17 | 0.25 | 0.03279 |
组氨酸 | 155.15 | 0.25 | 0.03879 | 亮氨酸 | 131.17 | 0.25 | 0.03279 |
精氨酸 | 174.20 | 0.25 | 0.04355 | 酪氨酸 | 181.19 | 0.25 | 0.04530 |
苏氨酸 | 119.12 | 0.25 | 0.02978 | 苯丙氨酸 | 165.19 | 0.25 | 0.04130 |
丙氨酸 | 89.093 | 0.25 | 0.02227 | 赖氨酸 | 146.19 | 0.25 | 0.03655 |
脯氨酸 | 115.13 | 0.25 | 0.02878 |
2.供试品溶液制备
精密量取/称取供试品适量，并配制成相应浓度的溶液备用。
3.衍生步骤
1）将恒温水浴锅预热至50±1℃；
2）分别将A、B两种衍生试剂用稀释剂稀释至原来浓度的1/5倍；
3）精密量取上述对照品溶液1ml，置于试管中，加入稀释后的A溶液0.5ml和稀释后的B溶液0.5ml，摇匀；在50±1℃水浴中加热45分钟，取出，加入正己烷溶液1ml，振摇；并用孔径为0.45μm有机膜过滤，放置30分钟后，取澄清的下层液进行分析试验；
4）供试品的衍生步骤与对照品相同；
四. 色谱条件
1.色谱柱：EXFORMMA Amino Acid，5μm，4.6×250mm；
2.梯度程序：
流动相A： 0.1mol/L醋酸钠溶液（pH 6.5）：乙睛＝93：7
流动相B： 水：乙腈＝20：80
T(min) | A% | B% | |
0.01 | 100.0 | 0.0 | |
11 | 93.0 | 7.0 | |
13.9 | 88.0 | 12.0 | |
14 | 85.0 | 15.0 | |
29 | 66.0 | 34.0 | |
32 | 30.0 | 70.0 | |
35 | 0.0 | 100.0 | |
42 | 0.0 | 100.0 | |
45 | 100.0 | 0.0 | |
60 | 100.0 | 0.0 |
流速：1.0ml/min
柱温：40℃
波长：254nm
进样量：5μl色谱图：
氨基酸标准品
溶解空白：
